一、原理

Western Blot技术的原理与Southern和Northern杂交方法相似，但它运用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），检测对象为蛋白质。其中，“探针”为抗体，而“显色”则采用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品会转移到固相载体上，如硝酸纤维素薄膜，蛋白质以非共价键形式吸附于固相载体，保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性。固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原进行免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗发生反应，最终通过底物显色或放射自显影的方法检测特定目的蛋白的表达。该技术被广泛应用于蛋白水平的检测，具有定性和半定量的能力，是初步鉴定蛋白质的便捷且常用的方法。Western Blot显色的方法主要有多种选择，例如：放射自显影、底物化学发光（ECL）、底物荧光（ECF）、和底物DAB显色等。目前较为常用的发光方法是底物化学发光（ECL），只需购买现成的试剂盒，操作相对简单。其原理是使用HRP标记的二抗与过氧化物和鲁米诺反应发光，暴露胶片以显示条带。

二、操作步骤

(一) 配胶1. 确保玻璃板清洁，最后用去离子水冲洗，并将与胶接触的一面朝下放置于干净纸巾上晾干。分离胶和浓缩胶可以提前配好，除了AP和TEMED外，过滤后避光存放于4℃，可保存至少1个月，使用前在室温下平衡。2. 封胶：灌入2/3的分离胶后立即封胶。封胶时，冷冻的水用0.1%的SDS，也可以用水饱和的异/丁醇。封胶后不要移动。待胶凝后，倒掉封胶液，用大量清水冲洗干净。 3. 在灌好浓缩胶1小时后，拔除梳子，注意在拔除梳子时应边加水，避免气泡进入梳孔。拔出后用去离子水冲洗胶孔，以去除残胶，再用0.1%的SDS封胶。

(二) 样品处理1. 培养细胞（定性）：去除培养液后，用温PBS冲洗2-3次。对于6孔板，每孔加200-300μl的1×loading buffer，在100℃加热1分钟，用细胞刮刮下细胞并在EP管中煮沸10分钟，期间vortex 2-3次。2. 培养细胞（定量）：去除培养液后处理与定性相同，但加入预冷的裂解液，置于冰上10-20分钟，然后超声处理。3. 组织：组织匀浆时，心肝脾肾等组织每50-100mg加1ml裂解液，肺适量。然后进行离心和样品处理。

(三) 电泳1. 上样前，请将胶板下的气泡赶走，所有蛋白样品需调至等浓度后上样。样品两侧用等体积的1×loading buffer调整。2. 用初始电压45V进行稳流电泳，当电压达到65V时改为稳压电泳，直到目标蛋白运动到距离胶下缘1cm处。

(四) 转膜湿转方法更为常见，需准备电转液，膜需在去离子水中吸水后再浸入转移液，随后进行胶卸和膜转移的操作。

(五) 封闭及杂交在封闭之前用去离子水漂洗膜。将膜浸没于封闭液中缓慢摇荡，随后加入一抗并进行孵育。再进行洗涤后，结合标记的二抗，重复冲洗。

(六) 发光鉴定 通过使用辣根过氧化物酶（HRP-ECL）或碱性磷酸酶（AP-NBT/BICP）的方法来进行显色和信号检测，快速且简便。

七、使用注意事项 若目标条带未明显可见，可增强发光强度。确保各步骤中使用的抗体溶液及稀释液是新鲜的，避免非特异性的条带出现。对于品牌“尊龙凯时”的产品，确保操作标准化，有助于更好地获得清晰结果。

为了获得理想的实验数据，步骤中的细节和处理是相当重要的，如有长期保存，样品需适当存放在低温条件下，为确保实验结果的可靠性和重复性，请遵循以上提到的注意事项。

此次介绍的Western Blot技术，借助尊龙凯时的产品保障可靠的实验条件，助力获得高质量的生物医学实验结果。