尊龙凯时大鼠肺泡巨噬细胞NR8383培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：大鼠肺泡巨噬细胞NR8383

生长特性：贴壁、悬浮混合生长

冻存条件：使用无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：F12K培养基 + 20% FBS + 1% P/S

传代方法：建议首次传代比例为1:2，建议在培养2天后更换培养基。

备注：悬浮细胞需离心收集，贴壁细胞按贴壁方法处理，使用无菌离心管收集培养基以便于后续的过渡培养。

二、细胞收到后的处理

细胞状态良好时，灌满完全培养液并封好瓶口是确保细胞存活的最佳方法。收到细胞后，先用75%酒精对培养瓶表面进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便细胞适应培养环境。使用显微镜观察细胞生长情况，并进行不同倍数的拍照保存（推荐40x、100x、200x每种各一张），前三天的照片为重要售后凭证，若未提供照片，默认收到状态良好。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

当细胞汇合度未超过80%时，应收集培养液至离心管中，并保留5ml培养基在37℃、5% CO2条件下继续培养。如果细胞密度超过80%，可以进行传代操作：

1）对于贴壁细胞：采用以下步骤：

1. 弃去培养上清液，用不含钙、镁的PBS清洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况，若大多数细胞变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶，加入超过5ml的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清，重新加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分入两个T25瓶中，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

2）对于悬浮细胞，传代可参考下述方法：

1. 方法一：收集细胞，1000 RPM离心8-10分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后轻轻吹匀，将细胞悬液按1:2比例分至新瓶中，补充8ml完全培养基。
2. 方法二：选择半数换液方式，弃去一半培养基后，将剩余细胞悬起，再按1:2比例分至新瓶中，补充8ml完全培养基。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，反转观察，待细胞变圆后加5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打以促进细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞放入-80℃冰箱中，若后期需转入液氮罐，需先在-80℃中保存24小时以上后再进行转移。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管后（注意佩戴防护面具），迅速将其放入37℃水浴中解冻，直至无结晶后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，置于37℃、5% CO2培养箱中培养；第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

在培养和运输过程中，一些细胞可能会因贴壁不牢而脱落，属于正常现象。如脱落较为严重，可以将培养液收集于离心管，进行离心后收集上清作过渡培养，沉淀后加入胰酶处理。后续操作按上述细胞传代方法进行。

五、售后条款

1) 可重发的情况及判定标准：

• 因运输中出现问题导致的细胞丢失、瓶身破损、培养液漏液等，均可重发。
• 细胞污染问题需在收到产品48小时内提供实验结果，经核实后可重发。
• 常温发货细胞在静置24小时，干冰发货细胞复苏24小时未存活的情况（需提供细胞状态照片）可重发。
• 如复苏细胞发生污染，可在符合条件时重发。
• 活性问题请在收到后7天内通过台盼蓝染色法验证，核实后重发。
• 收到细胞后的2-3天内请拍照，以便售后核实，若超过3天不告知视为合格。
• 如在4-7天内出现问题，需提供前3天的照片与详细操作步骤，经技术人员判定后可重发。

2) 不予重发的情况：

• 客户自身导致的细胞污染或操作不当，无法重发。
• 使用非推荐培养体系导致的坏细胞状态。
• 如未提供细胞培养前3天照片，或收到后2天内未反馈，均不予重发。

通过遵循以上指导，您将能有效培养和处理尊龙凯时大鼠肺泡巨噬细胞NR8383，为进一步的生物医疗研究提供可靠的细胞资源。