细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作息息相关。上周我们讨论了细胞冻存中的常见错误，详见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇将从复苏的角度探讨复苏过程中可能出现的问题。

首先，让我们回顾一下细胞复苏的步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，同时将培养基复温，并设置好离心机的转速。
2. 准备一个15ml离心管，加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，迅速将其浸入水浴锅中，并摇晃使细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液缓慢滴入预先加了培养基的离心管，进行1000rpm的离心，时间为3分钟。
5. 弃掉上清液，重悬细胞后接种至培养器皿中，并放入培养箱。

接下来，我们来看看复苏过程中常见的错误操作：

1. 运输不当： 如果液氮罐或冰箱距离水浴锅较远，且没有采取保冷措施，细胞在运输过程中可能会开始融化（尤其是在夏季）。冻存细胞应放在干冰或冰盒中运输至水浴锅。

2. 手触碰冻存管： 在运输冻存管时，避免用手碰触到细胞部分或将其放入口袋中。应捏住管盖或放入容器中进行运输，以避免局部温度升高导致细胞开始融化。

3. 错误的融化方式： 不要使用手捂的方法来融化细胞。手心的温度通常不足以有效融化细胞，这样会导致细胞受热不均匀且降温速度过慢，从而造成细胞死亡。

4. 水浴时间控制不当： 在水浴过程中，没有严格控制时间，直接将冻存管放入水中静置，而不进行摇晃，这违背了“快融”的原则。建议在2分钟内充分融化细胞，水浴时间越长活细胞率越低。最佳方法是捏住管盖，将管身浸入水中并快速摇晃，以加速细胞融化。

5. 冰块未完全融化： 若在水浴结束时冻存管内仍有较大冰块，可能导致细胞死亡。一方面，冰块中的细胞会缓慢升温而死亡；另一方面，冰块可能对已融化的细胞造成低温损伤。如有困难在2分钟内融化，建议将水浴锅温度调至39℃（个人亲测可行），并加快摇晃速度。若担心污染，可将冻存管放在一次性PE手套内进行水浴。

6. 忽视DMSO去除： 细胞融化后，如果不进行离心去除DMSO，而直接用10倍培养基稀释，等细胞贴壁后再换液，虽然适合一些好养的贴壁细胞，但并不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞具有一定毒性，尤其是对于对其敏感的细胞（如HL-60细胞）。若不确定细胞是否对DMSO敏感，还是离心去除上清液为佳。

上述内容是根据小尚多年的经验总结的，结合冻存篇，可以有效解决多数复苏失败的问题。如还有未提及的知识点，欢迎各位同学在评论区补充。

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