近期，许多学生向小尚反映细胞复苏过程中遇到问题。虽然复苏是细胞培养中的一项常规操作，但其中的许多细节往往被忽视。复苏的成败与冻存和复苏操作息息相关，稍有不慎便可能留下遗憾。这篇文章将主要从冻存的角度进行分析，下一周将更新复苏操作的原因排查，欢迎同学们收藏关注。

冻存步骤复习

我们先回顾一下细胞冻存的基本步骤：

1. 提前准备好冻存液。
2. 离心获得细胞沉淀后，加冻存液轻轻重悬细胞。
3. 将细胞悬液转移入冻存管。
4. 如果使用程序冻存液，将冻存管放入程序冻存盒，放入-80℃冰箱过夜后再转入液氮保存。如果使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

冻存常见错误操作

1. 缺乏保温措施

使用常规含血清冻存液时，未采用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施，导致降温过快形成冰晶，进而破坏细胞结构。建议使用市售的程序冻存盒，确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。若没有冻存盒，可将冻存管放于泡沫盒中，4℃静置5-10分钟，再转入-20℃静置2小时，最后放入-80℃冰箱过夜，次日再转入液氮保存。无论是用程序冻存液还是无血清非程序冻存液，选择合适的材料至关重要。

2. 细胞状态不佳

冻存前细胞的状态直接影响复苏的成功率。需选择对数生长期、汇合度超过80%的细胞进行冻存。如培养上清呈橘黄色，建议更换培养液后静置4小时再进行冻存。合理的冻存密度应保持在200-300万/mL/管，便于后续复苏。

3. DMSO操作不当

切忌直接将DMSO加入细胞悬液而不事先配制冻存液。由于DMSO在被稀释时会放热，且对脆弱细胞造成负面影响，因此建议先配制冻存液后再处理细胞。

4. 直接放入液氮

冻存液重悬细胞后应避免直接放入液氮，液氮的温度为-196℃，未经梯度降温的细胞在此温度下将快速死亡。切忌将细胞直接放在液氮罐口降温。

5. 底料成分不适

研究显示，5%-10%的DMSO最适合细胞冻存。具体比例需根据细胞种类进行调整，特别是对DMSO敏感的细胞需要降低使用比例。根据小尚的经验，8%DMSO适用于大多数细胞系。同时，难以培养的细胞需要增加血清比例。为确保后续实验顺利，建议在冻存前进行冻检，保证细胞状态良好后再进行大批量冻存。

6. 冻存条件不当

液氮保存的稳定性通常优于-80℃冰箱，因此在条件允许的情况下应优先选择液氮存储。若没有液氮罐，应将冻存管置于-80℃冰箱内部，并定期检测细胞活性。

未完待续。有关细胞复苏的更多信息及技巧，感谢大家关注尊龙凯时，我们将持续为您提供生物医疗领域的最新知识与技术更新！